Pour cristalliser le lysozyme, nous avons réalisé deux méthodes:

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La méthode de la goutte suspendue

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Matériel :

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 -boîte de culture de tissus Linbro à 24 puits

 -lamelles

 -graisse pour l’étanchéité

 -pipette

 -solution de lysozyme (protéine de blanc d’œuf) de concentration 20mg/ml

 -solution de chlorure de sodium de concentration 5M

 -tampon (solution d’acétate de sodium /acide acétique) de concentration 50 mM

 

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Étaler un film régulier de graisse sur les rebords de chaque compartiment.

Remplir dans chaque réservoir de la boite la quantité suffisante de solution de NaCl et de tampon afin d’obtenir 1mL de concentrations différentes.

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Pour chaque compartiment, déposer sur une lamelle 2µL de solution de lysozyme et y ajouter 2µL de la solution du réservoir correspondant.

Retourner la lamelle pour refermer ce compartiment et vérifier l’étanchéité de l’installation.

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La dialyse

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Matériel:

-Boîte de culture de tissu Linbro à 24 puits

-Lamelles, graisse pour l'étanchéité, pipette

-Boutons de dialyse, membrane de dialyse

-Solution d'agent cristallisant : chlorure de sodium

-Solution de lyzozyme

-Tampon acétate de sodium/ acide acétique

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Protocole expérimental:

-Etaler un film régulier de graisse sur les rebords de chaque compartiment d'une rangée de puits de la boîte Linbro.

-Remplir chaque réservoir par 2ml de solution de NaCl à la concentration désirée

-Pour chaque bouton, déposer la solution de protéine dans le puit du bouton de dialyse. La solution de protéine doit former un léger dôme (excès) afin d'éviter de créer une bulle d'air.

-Recouvrir le bouton par un morceau de membrane de dialyse en prenant soin d'éviter la formation de bulles d'air.

-Plonger le bouton dans le réservoir et fermer le compartiment à l'aide d'une lamelle.

-Stocker la boîte à 18°C.

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Nous avons testé différentes concentrations de NaCl avec ces deux méthodes: 0,7M; 0,8M; 0,9M; 1,0M; 1,1M et 1,2M. 

(M signifie ici Molaire).

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    2. Observations

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Une semaine après avoir réalisé l’expérience, nous avons pu passer aux observations. Pour cela, nous avons utilisé une loupe binoculaire, car les cristaux ne mesurent pas plus de quelques micromètres. On utilise également la technique du polariseur, qui est un outil permettant la réfraction de la lumière et donc de toutes les couleurs dans le cristal observé. Tous les plans cristallins sont ainsi représentés, afin d’observer sa pureté.

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Dans la boîte contenant les cristaux faits avec la technique de la goutte suspendue, tous les puits n’ont pas cristallisé. Dans certains, il y a formation d’oursins. Les oursins sont de tout petits germes de cristaux qui ne se sont pas correctement développés.

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Il y a également formation de fibres, c’est-à-dire des cristallisations ratées qui se font dans une seule dimension.

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Heureusement, certaines solutions de lysozyme ont bien cristallisé. Les cristaux sont tous différents. Ils sont plus ou moins gros et comportent des défauts, comme des fissures ou des craquelures.

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Nous avons également observé les échantillons faits au robot. Le lysozyme a commencé à cristalliser à partir de la 5ème colonne et donne certains cristaux purs d’autres avec des défauts.

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Cristaux formés avec le robot :

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Pour la dialyse, le résultat est moins concluant. Les cristaux ne sont pas bien formés :

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                                                               On observe ici des oursins ainsi que des cristaux dans le même bouton de dialyse.

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    3. Résultats de nos observations

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Les cristaux cristallisent en fonction d’un facteur majeur : la concentration en NaCl mise dans le réservoir.

Les chercheurs cherchent la concentration idéale pour avoir une nucléation et une croissance, afin de créer un bon cristal. Les cristaux ayant le mieux cristallisé étaient ceux de 0,8M, 1M et 1,2M : ces concentrations sont les plus favorables à la formation de cristaux de lysozyme, bien que nous ayons obtenu des cristaux impurs, dus à une croissance trop rapide donc entraînant des défauts.

La méthode la plus utilisée est celle de la goutte suspendue pour trouver la concentration la plus apte à créer le cristal. Les chercheurs utilisent principalement la méthode du robot parce qu'elle permet de tester des échantillons plus larges mais on constate que les résultats obtenus manuellement sont meilleurs. La dialyse quant à elle s'est avérée moins efficace sur notre expérience.